1.    세포투과성 펩타이드 연구배경
 
세포투과성 펩타이드 (Cell Permeable Peptide)는 일종의 신호 펩타이드 (Signal Peptide) 로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열의 조합인 펩타이드이다. 주로 약 7개-30여개 정도의 아미노산 서열로 이루어지며, HIV 바이러스에서 유래된 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열의 b-galactosidase (120 kDa) 단백질의 세포내 및 조직내 전달이 가능하다는것을 보여준 1990년대 이후에 본격적으로 관련 연구가 진행이 되어졌다. 초파리의 단백질에서 유래한 Antennapedia (Penetratin), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22, Simian Virus 40 large antigen T 로부터 유래한 Pep-1 이 대표적인 1세대 세포투과성 펩타이드로 여겨지며 TAT과 함께, 많이 사용되고있는 펩타이드들이다. 또한, poly Arginine, poly Lysine 과 같이 단순히 Arginine, Lysine 과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러개가 연결된 펩타이드도 세포투과능력이 뛰어난 것으로 보고되었으며, 다양한 cargo전달에 응용되고 있다. 그러나 대부분 이러한 세포투과성 펩타이드는 인간단백질 유래의 서열이 아니며, 면역원성, 독성의 가능성을 내포하고 있고, 인간세포에 전달되는 효능이 떨어지는것으로 여겨진다. 따라서, 인간단백질 유래의 새로운 세포투과성 펩타이드에 대한 연구가 진행되어져왔으며, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2 와 같은 세포투과성 펩타이드는 인간 단백질 유래의 서열로서 2세대 세포투과성 펩타이드로 여겨진다.
 
2.    세포투과성 펩타이드를 활용한 다양한 고분자물질의 전달 및 응용
 
현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 고분자 물질의 세포내 전달 및 이를 통한 응용이 진행되어져왔으며, 특히 SOD, Catalase, SOCS 와 같은 enzyme, dnPI3K, ZAP70 mutant와 같은 세포내 신호전달 단백질의 저해 형태의 단백질, Foxp3, RORgt 와 같은 전사인자 단백질 혹은 전사인자의 DNA binding domain 부분 과 같이 다양한 단백질 전달을 통해 세포내 기능을 조절하고자 하는 시도가 되어졌다. 특히 cyclosporinA 와 같은 저분자 화합물 약물을 세포내 및 조직내로 전달하여 장기 및 세포 이식시 발생하는 거부반응을 조절하고자 하는 시도, psoriasis 와 같은 자가면역을 조절하고자 하는 시도가 진행되어져 왔다.

예를 들어, 단백질 전달을 이용한 치료로는 N-말단의 인산화 부분이 없는 IκB를 전달하여 NF-κB 활성을 억제하여 관절염을 치료하려는 시도가 이루어졌으며, 펩타이드를 전달하는 시도로 종양억제유전자인 p53 을 활성화시킬 수 있는 p53의 C-말단 펩타이드 서열을 전달하여 종양을 억제하고자 하는 연구, NFAT 신호전달을 억제하는 펩타이드인 VIVIT을 전달하여 동종 췌장이식에 적용하는 연구 등이 이루어졌다.

유전자 전달을 이용한 질병치료도 활발히 연구되고 있는데, 예를들어 수지상세포의 공동자극신호 (co-stimulatory molecule)인 CD86에 대한 siRNA를 전달하여 수지상세포의 이동을 막아 접촉성 피부염을 저해하려는 연구, 세포투과성펩타이드 융합 GATA4 전사인자 유전자를 형질주입한 심장 섬유아세포를 심장에 이식하여 심근병증을 치료하려는 연구 등이 이루어졌다.

또한, siRNA의 in vivo 전달에 의한 표적 유전자 knock down 효과를 RNA binding 단백질에 세포투과성 펩타이드를 연결하여 생쥐에 전달하여 표적 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 기술로 적용할 수 있었으며, 최근에는 iPS 세포를 만들기 위하여 Yamanaka Factor 단백질들을 세포투과성 펩타이드와 연결하여 fibroblast 로부터 viral vector 에 의한 over expression 을 대체하여 단백질 기반의 iPS 만드는 기술에 적용되기도 하였다. Cre, Crisper-Cas9 에 의한 gene editing 기술에도 세포투과성 펩타이드를 이용하여 Cre, Cas9 단백질을 세포내로 전달하여 유전자가위 적용 기술로서 응용이 되기도 하였다.

뿐만아니라, 저분자 화합물을 전달하여 질병을 치료하려는 시도도 많이 이루어졌으며, 연구의 대표적인 예는 methotrexate과 doxorubicin으로 암세포나 감염성 질환 치료 연구에 사용되고 있다. 세포투과성 펩타이드는 질병 치료 연구뿐만 아니라 이미징 분야에도 활용되고 있다. 치료물질 대신 형광물질 혹은 Quantum dot, 나노입자를 사용하여 아래에 언급될 세포특이적 세포투과성펩타이드 기술을 이용해 특정 세포의 이미징 또는 실시간 추적등을 가능하게 한다.
 
3.    세포투과성펩타이드의 세포특이적 전달기술로의 개선
 
일반적으로 세포투과성 펩타이드는 표적 세포에 대한 특이성이 없어서 모든 세포에 들어갈 수 있다는 점이 장점이자 전신적 약물전달에 있어서는 단점으로 여기질 수 있어서 최근에는 이러한 세포투과성 펩타이드에 세포특이적 전달기술을 접목한 방법들이 시도되었다. 그런데 면역 결핍 쥐에 암세포를 주입하면, 세포투과성 펩타이드가 암세포 및 암조직으로 더 특이적으로 전달이 될 수 있다는 보고들이 있었으며, 따라서 세포의 종류에 따라 그 전달 효능이 차이가 있는것으로 사료된다. 세포 특이적 전달을 가능하게 하기 위하여, 최근에는 특정 분자와 결합할 수 있는 타겟팅 펩타이드 서열을 연결하여 세포특이적 전달효율을 증가시키는 방법과 세포 밖이나 내부에서만 세포투과능이 활성화되는 세포투과성펩타이드 (Activatable Cell Penetrating Peptide, CPPs)가 활발히 연구되고 있다. 타겟팅 펩타이드서열은 특정 세포에서 발현하는 분자에 결합하는 특성을 이용한 방법으로, 유방암세포에서 많이 발현되는 ErbB2 타겟팅 서열인 AHNP, 다양한 암세포에서 발현하는 CXCR4를 타겟팅 할 수 있는 서열인 DV3, transferrin 수용체에 붙을 수 있는 B6 peptide, α_vβ₃ integrin에 결합 가능한 c(RGDfK) 등 다양한 타겟팅 서열이 밝혀졌다.

ACCP의 대표적인 예로 pH-sensitive 시스템과 enzyme-sensitive 시스템이 있다. pH-sensitive system으로는 대표적으로 혈중 pH에서는 음전하를 띠고 있어 세포투과성펩타이드와 전기적 결합을 하고 있다가 약산성을 띠는 암세포 주변의 pH에서 중성이 되어 세포투과성 펩타이드로부터 분리되어 세포특이적 전달을 가능하게 하는 pH-sensitive sulfonamide (PSD) 방식과 약산성의 환경에서 잘리는  pH-sensitive hydrazine linker를 이용한 방식이 있다. 반면 enzyme-sensitive 시스템은 특정세포에서 특이적으로 발현하는 효소 (예를 들면 MMP)에 의해 잘리는 아미노산 서열이 linker가 되어 음전하를 띠는 attenuator를 헤어핀 (hairpin) 구조로 세포투과성펩타이드의 양전하를 중성화시키며, 특정 세포 근처의 효소에 의해 linker가 잘려 attenuator와 함께 분리되도록 하는 방식이다. 그밖에도 빛 (UV)에 의해 잘리는 Nvoc 그룹을 이용한 light-sensitive 시스템, 산소에 의해 degradation 되는 HIFα의 Oxygen-dependent degradation domain (ODD)를 이용하여 hypoxy 상태인 암세포 주변에서 안정적으로 유지되도록 만든 oxygen-sensitive 시스템등이 있다. 이러한 타겟팅 펩타이드서열과 ACPPs는 리포솜 또는 나노입자등과 함께 사용되어 다기능 약물전달 시스템 (Multifunctional drug delivery system)으로 개발되고 있다.
 
4.    세포투과성펩타이를 활용한 시도되었던 임상시험 약물
 
이렇게 오랜 기간동안 세포투과성 펩타이드에 대한 연구와 그 응용에 대한 연구가 이루어졌는데, 물론 세포투과성 펩타이드를 이용한 신약개발 노력으로서 TAT을 이용한 임상시험중인 약물들이 있다. 대표적인 약물로는 KAI-9803 (KAI Pharmaceuticals), KAI-1678 (KAI Pharmaceuticals), KAI-1455 (KAI Pharmaceuticals), XG-102 (Xigen) 등이 있으며 TAT의 아미노산 서열 변경을 통해 효율을 증가시킨 PTD4를 이용한 AZX100 (Capstone Therapeutics), R8 펩타이드를 이용한  Psorban (Cellgate) 등이 있다. KAI Pharmaceuticals의 pipeline은 Protein Kinase C 종류의 activator 혹은 inhibitor peptide 를 이용하여 심근경색 (KAI-9803, Phase II), 통증 (KAI-1678, Phase II), 국소빈혈 (KAI-1455, Phase I) 등을 치료하는 신약 후보물질들로 구성되어 있다. Xigen사의 XG-102는 JNK inhibiting peptide를 이용해 염증 (Phase III), 난청 (Phase II, III) 치료에 좋은 효과를 보이고 있으며 활발히 연구중에 있다. 반면, Capstone Therapeutics의 AZX100과 Cellgate의 Psorban은 임상 2상까지 진행되었으나 현재 개발이 중단된 상태이다.

그 밖에, 28개 아미노산 서열로 세포투과능을 가지고 있으면서 암세포의 세포주기를 억제할 수 있는 Pediatric Brain Tumor Consortium의 NSC745104 (Phase I), TAT과 lysine backbone을 결합한 TransMTS 라는 독자적인 기술로 botulinum toxin을 피부로 국소전달하여 주름개선에 효과를 보이고 있는 Revance Therapeutics 사의 RT001 (Phase III), glioma에 특이적으로 발현되는 LRP1에 결합하여  transcytosis로 BBB 를 투과해 paclitaxel을 전달해 뇌로 전이된 암세포를 제거할 수 있는 Angiochem의 GRN1005 (Phase II) 등도 있다.
 

출처 : Ther Deliv. 2013 May;4(5):573-91.

5.    세포투과성펩타이드의 바이오신약 개발로의 응용전망
 
HIV 바이러스의 TAT 단백질이 세포내로 전달이 될 수 있다는 보고가 1988년도에 Cell 지에 보고된 이래에 세포투과성 펩타이의 세포내 전달 기작이 밝혀지고, 양이온성 아미노산, 소수성 아미노산이 세포막 단백질 및 지질과 결합하여 전달이 될 수 있는것으로 밝혀졌고, 단백질, 펩타이드, DNA, RNA 등 다양한 고분자 물질의 전달이 in vitro와 in vivo 동물 모델에서 다양하게 확인이 되어졌다. 그러나, 그동안 시도되었던 많은 세포투과성 펩타이드와 결합된 바이오신약 후보물질의 임상 실패는 인간세포에 전달 효능이 매우 떨어지거나 cargo 의 효과가 떨어지는것으로 사료되며, 최근에 동정되어 발표되고 있는 인간세포에 전달이 잘 되는 세포 투과성 펩타이드를 활용하여 적용한다면, 세포내 신호전달을 조절할 수 있는 다양한 단백질 및 펩타이드 등 고분자 물질을 활용한 새로운 개념의 바이오신약개발이 이루어질 수 있을것으로 기대하며, 또한, 이러한 세포투과성 펩타이드를 활용하여 항체를 세포내로 전달할 수 있으므로 항체 신약개발의 표적을 세포막 단백질, 수용성 단백질에서 세포내 단백질로 확대해 나갈 수 있는 큰 파급력이 있는것으로 기대된다. 또한, 최근 임상3상까지 진행이되고있는 약물들이 있어서, 앞으로 세포투과성 펩타이드를 이용한 약물로서 한두가지 성공사례가 나온다면, 매우 다양한 방법으로 세포투과성 펩타이드를 응용한 바이오신약의 성공사례가 연속적으로 나올 수 있을것으로 전망한다.

이러한 신약개발의 성공을 위해서는 세포투과성 펩타이드는 heparin sulfate, sialic acid, phosphatidyl serine 등 특정분자의 발현이 많이 있는 세포에 더욱 지향성을 가지고 전달이 되므로, 약물개발의 표적 세포, 표적 조직을 적절히 결정하여 활용하는 전략이 필요한것으로 사료된다. 점막조직의 표피세포, 혈관의 내피세포, 대식세포는 세포투과성 펩타이드의 가장 좋은 표적 세포들이며 관련 질병에 접근하는것이 매우 적절한것으로 사료된다. 또한, 간조직, 비장, 소장, 대장은 생쥐에 복강주사 및 정맥주사시 가장 잘 전달이 되는 조직으로서 관련된 질병에 약물개발에 활용하는것이 좋을 것으로 사료된다. 또한 국소적 전달을 통해 안과적 질환, 호흡기질환, 피부질환에 응용 가능성이 매우 높으며 최적의 전략을 통해, 앞으로 인간 단백질 유래의 고효율 세포투과성 펩타이를 응용한 다양한 바이오신약개발이 이루어질 수 있을 것으로 기대한다.